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目的タンパク質（抗原）に対する抗体（捕獲抗体）を固相に吸着させる。 スキムミルクなどで固相のブロッキングを行う。 固相に試料溶液および捕獲抗体とは別のエピトープを認識する一次抗体を加える。この時点で、固相 - 捕獲抗体 - 抗原 - 一次抗体という複合体が固相表面に形成される。 反応しなかった抗原および一次抗体を洗い流す。